Изучение иммунобиологических свойств секретируемых белоксодержащих антигенов Klebsiella pneumoniae

  

ВОЮШИН Константин Евгеньевич



ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ СЕКРЕТИРУЕМЫХ БЕЛОКСОДЕРЖАЩИХ АНТИГЕНОВ Klebsiella pneumoniae



АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук



003054280



На правах рукописи



МОСКВА-2007



003054280



Paoora выполнена в Г У НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН



Научные руководители:



Доктор медицинских наук Екатерина Алексеевна Курбатова Доктор медицинских наук Федор Витальевич Доненко



Официальные оппоненты:



Доктор медицинских наук, профессор Людмила Ивановна Краснопрошгта Доктор биологических наук Галина Георгиевна Честухина



Ведущее учреждение: ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича



Защита диссертации состоится 22 февраля 2007 г. в 12 часов на заседании диссергаиионного совета Д 001.035.01 при ГУ ПИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова PAMI1 (105064 Москва, Малый Казенный пер. д.5а)



С диссершшей можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМИ



Автореферат разослан " JfofofJj " 2007 г.



Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук



Актуальность темы. Одним из наиболее важных с медицинской точки зрения представителей рода Klebsiella является Klebsiella pneumoniae sp pneumoniae - широко распространенный возбудитель инфекционных процессов различной локализации. Есть данные о возможной роли К pneumoniae в манифестации и обострениях болезни Бехтерева у НЬА-В27-позитивных лиц [A. Ebringer 2000, M. L.Dominuez Lopez et al. 2002, A. Cauli et al.2002].



На протяжении последних десятилетий К pneumoniae занимает одно из первых мест в структуре внутрибольничных инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами [Т. Horan et al. 1988; D. R. Schaberg et al. 1991; E. Bergogne-Berezin 1995; В. Н.Красноголовец и Б. С.Киселева, 1996; H. Sahly et al. 2000; A. Hostacka, 2001; Cheol-in Kang et al. 2006]. К группе высокого риска инфицирования относятся пациенты с иммунодефицитом, новорожденные, лица пожилого и старческого возраста [R. Podschun et al. 1998; R. Sinha et al. 2003]. Летальность от клебсиеллезного сепсиса и пневмонии составляет 20-50% [C. S.Brayan et al. 1983, M. J.de la Torre et al. 1985].



Недостаточная эффективность традиционной терапии, обусловленная растущей полирезистентностью штаммов к антибиотикам, определяет необходимость разработки иммунологических препаратов для активной иммунизации контингента групп риска, а также для иммунотерапии тяжелых случаев клебсиеллезов при использовании гипериммунной донорской плазмы, клебсиллезного иммуноглобулина или других средств пассивной иммунотерапии [L. Brade et al. 2001].



Б настоящее время в клинической практике применяют только бактериальные поликомпонентные вакцины для активной иммунотерапии пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями, вызываемыми условно-патогенными микроорганизмами, содержащие в своем составе антигены К pneumoniae (рибомунил, бронхомунал, респивакс, иммуновак-ВП-4 и др.) [F. B. Michel et al, 1978; А. Bosch et al. 1983; Б. Пертунов и др. 1991; Е. А. Курбатова, 1997; М. Р. Богомильский и др. 2001]. Эти препараты предназначены, прежде всего, для коррекции вторичного иммунодефицита.



Многолетние исследования по разработке противоклебсиеллезной вакцины не привели к созданию эффективного препарата, используемого в практике здравоохранения. В качестве наиболее перспективных антигенов для получения вакцин рассматривали капсульный полисахарид или липополисахарид (ЛПС) К pneumoniae [S. J. Cryz, 1984, 1986; Bennett-Guerrero et al. 2000]. Роль белоксодержащих антигенов К pneumoniae изучена недостаточно. В последнее время появились сообщения об иммуногенной активности белков наружной мембраны К pneumoniae, характеризующихся высоким уровнем гомологии у представителей семейства Enterobacteriaceae [Р. Jeannin et al. 2002].



Секретируемые белоксодержащие компоненты К pneumoniae, представленные ферментами (протеазы, гликозидазы и др.), токсинами, гемолизинами, белками теплового шока и др. с целью получения протективных антигенов, практически не изучались. Высокая консервативность аминокислотной последовательности этих соединений у разных штаммов К pneumoniae открывает новую область их применения для получения антигенов с внутри - и, возможно, межвидовой перекрестной протективной активностью.



Цель исследования. Получение и характеристика иммунобиологических свойств секретируемых белоксодержащих антигенов К. pneumoniae



Задачи исследования:



1. Получить из культуральной надосадочной жидкости штаммов К. pneumoniae различной i гепени вирулентности белоксодержащие соединения и определить протеазную активность полученных фракций



2 Изучить протективную активность секретируемых белоксодержащих фракций К pneumoniae при заражении гомологичным и гетерологичными K-типами К. pneumoniae.



3. Дать химическую и иммунохимическую характеристику препаратов, полученных на основе секретируемых белоксодержащих фракций К pneumoniae



4. Исследовать иммунный ответ у животных при иммунизации секретируемыми белоксодержащими фракциями К pneumoniae



5. Изучить действие секретируемых белоксодержащих фракций на формирование неспецифической резистентности к инфекции и их противоопухолевую активность в экспериментах на животных.



6. Определить диагностическую значимость секретируемых белоксодержащих антигенов в ИФА при анализе здоровых и больных болезнью Бехтерева.



Научная новизна. Впервые при культивировании К. pneumoniae на полусинтетической среде получены протективные секретируемые белоксодержащие фракции, определены их иммунобиологические свойства и дана химическая и иммунохимическая характеристика.



Установлено, что штаммы К pneumoniae К2, К16 и нетипируемого по К-антигену штамма №204 продуцируют только один вид протеазы с молекулярной массой 21 кДа, обладающую эластазоподобной активностью, которая не зависит от степени вирулентности штамма и возрастает при прибавлении в среду культивирования субстрата протеазы - гликопротеина. Обнаружено, что фракция, содержащая данный фермент не обладает протективной активностью. Показано, что при внесении в среду культивирования гликопротеина происходит повышение продукции штаммами К pneumoniae белоксодержащих соединений в области 50 кДа и углеводсодержащих соединений в областях 25, 50, 60 и 70 кДа.



Установлено, что внутривидовой протективной активностью обладает фракция 30-50 кДа, содержащая белок, углеводы и примесь ЛПС. Основные белковые компоненты фракции имеют молекулярную массу 35 и 40 кДа и являются общими для всех исследованных штаммов (К2, К16, 204). ПротеолЬтическое разрушение белка приводит к утрате защитных свойств препарата. Методами проточной цитофлюориметрии и ИФА показано, что белоксодержащие фракции относятся к секретируемым антигенам, а не являются продуктами лизиса микробных клеток.



Показано, что препарат К. рпеитотае К2, полученный на основе фракции с молекулярной массой 30-50 кДа приводит к выработке специфических антител IgG класса, повышает уровень цитокинов IL-6, TNF-a, IL-10, IL-12 в сыворотке крови



Мышей, но не является активным стимулятором неспецифической резистеност организма при испытанных дозах и схемах введения.



Выявлено, что сыворотки крови пациентов с болезнью Бехтерева содержа антитела к белоксодержащей фракции 30-50 кДа, иммунизация которой не приводи к образованию антител к органонеспецифическим и органоспецифически антигенам человека.



Практическая значимость. Секретируемая белоксодержащая фракция К pneumoniae К2 30-50 кДа может быть использована как основа для разработк противоклебсиеллезной вакцины с внутривидовой перекрестной протективно активностью для активной иммунизации пациентов групп риска и получен гипериммунной плазмы для терапии тяжелых случаев клебсиеллезной инфекции, также для разработки диагностических тест-систем.



При получении препаратов на основе секретируемых белоксодержащи фракций микроорганизмов, культивируемых на синтетических ил полусинтетических средах, можно использовать гликопротеин для определения ориентировочного диапазона локализации протективных антигенов, продуцируемых микробной клеткой в среду культивирования.



Расшифровка аминокислотной последовательности секретируемых протективных белков К. pneumoniae может явиться предпосылкой для получения генно-инженерных вакцин и иммуногенов.



Использование указанных подходов по получению протективных антигенов. да основе секретируемых белоксодержащих фракций К. pneumoniae может быть применено к получению протективных антигенов из других микроорганизмов.



Основные положения, выносимые на защиту



1. К pneumoniae продуцирует в культуральную среду только один вид протеазы с молекулярной массой 21 кДа, обладающую эластазоподобной активностью, которая не зависит от степени вирулентности штамма.



2. Внутривидовая протективная активность секретируемых белоксодержащих антигенов К pneumoniae сосредоточена во фракции 30-50 кДа и определяется белками с молекулярной массой 35 и 40 кДа.



3. Протективная активность секретируемой белоксодержащей фракции К. pneumoniae К2 30-50 кДа реализуется по антителозависимому механизму санации организма от клебсиеллезной инфекции при участии специфических антител, в том числе IgG класса.



4. Сыворотки крови пациентов с болезнью Бехтерева содержат антитела к белоксодержащей фракции 30-50 кДа, иммунизация которыми не дает перекрестных реакций с органонеспеспецифическим и органонеспецифическим антигенами человека.



Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология 21 век» (г. Саратов, 28-30 сентября 2004), Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» («Сосновка», Новосибирская область, 8-10 сентября 2004 г.), на заседании Ученого совета НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН 11 апреля 2006. Апробация работы состоялась на конференции отдела иммунологии ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН 13 декабря 2006 г.



Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научных работы, из низ 2 в журналах рекомендованных ВАК РФ, подана 1 заявка на изобретение.



Структура и объем диссертации. Материалы работы изложены на 142 страницах компьютерного текста и состоят из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы — 199 источников (24 отечественных и 175 зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована - 23 таблицами, 9 рисунками и 1 фотографией.



СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ



МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ



Лабораторные животные. Мыши: белые беспородные (n<1200), СВА из



Питомника Академии медицинских наук РАМН (Крюково) - (n<50); С57В1/6, самцы, из питомника «Столбовая» Московской области (п<40).



Штаммы микроорганизмов. K. pneumoniae К2 (В5055), К13 (№8660), К16



(№2046-79), К25 (2002-49-S), К48 (№229) из Эталонной международной коллекции



Клебсиелл и штамм №204 (ГИСК им. JI. A. Тарасевича). Штаммы любезно предоставлены завлабораторией микробиологии условнопатогенных бактерий д. м.н. проф. А. П.Батуро).



Определение вирулентности штаммов К pneumoniae проводили на беспородных белых мышах массой 14-16 г. при внутрибрюшинном заражении и определяли LD50.



Получение белоксодержащих фракций из культуральной надосадочной жидкости штаммов K. pneumoniae представлено на рис. 1.



Штаммы К pneumoniae культивировали в ферментере фирмы «Анкум» с рабочим объемом 10 л при непрерывном перемешивании и подаче воздуха при рН 7,8 t 37°С в течение 6 часов. (Лаборатория непарентеральных методов иммунизации ГУ НИИВС им. И. И. Мечникова РАМН, зав. лаборатории д. м.н. проф. В. В. Сергеев).



Полученную микробную суспензию инактивировали 2% азидом натрия в течение 2 часов при 18-20 °С. Полноту инактивации микробных клеток контролировали путем высева на питательный агар.



Культивиров ание



Получение культуральной надосадочной жидкости |



Ге льфильтраи^ я



Ионообменная хроматография



Ультрафильтрация



Изучение влияния условий культи в иро в ани я



Изучение_ протеазной активности



Изучение протективной активности



Рис. 1. Схематическое изображение методов получения и использования белоксодержащих антигенов культуральной жидкости К pneumoniae.



Надосадочную жидкость получали центрифугированием при 4000g в течение 30 минут при 4°С. Белоксодержащие фракции осаждали сульфатом аммония, навеску которого прибавляли к полученному супернатанту до 80% насыщения по методу N. Koide et al. 1974. Осадок ресуспендировали в 50 мл 100 мМ Na-фосфатного буферного раствора (рН 7,4). Остатки сульфата аммония удаляли при помощи хроматографии на колонке PD-10 в 100 мМ Na-фосфатном буферном растворе (рН 7,4). Фракционирование полученного препарата проводили тремя методами.



В первом случае проводили фракционирование с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-75 (Pharmacia, Швеция) в 100 мМ Иа-фосфатном буфере (рН<7,4). Колонка была предварительно уравновешена 100 мМ Ыа-фосфатным буфером (рН<7,4), содержащим 0,1% СТАВ, и откалибрована с помощью стандартных белков.



Во втором случае - при помощи ионообменной хроматографии на DEAE-сефарозе в градиенте NaCl (от 0 до 0,5 М).



В третьем случае - при помощи последовательной ультрафильтрации с использованием ячейки Amicon (Millipore Corp, США) и мембран YM-100, YM-50, YM-30 и YM-10 (Millipore Corp, США) с пределами исключения 100, 50, 30 и 10 кДа соответственно. Полученные белоксодержащие фракции <30, 30-50, >50 и >100 кДа использовали для определения протективной активности.



Протеазная активность. Эластазоподобную активность определяли по скорости расщепления N-тетра-бутокси-карбонил-аланин-нитрофенилового эфира (BOC-Ala-ONp) [Schwert G. et a. 1955 ], трипсиноподобную - N-альфа-бензоил-Ь-аргинин-этилового эфира [Visser C.,et al. 1972], химитрипсинподобную - N-ацетил-L-тирозин этилового эфира [Schwert G. et al 1955].



Молекулярную массу белоксодержащих фракций определяли с помощью электрофореза в ПААГ по методу Леммли [Laemmli U. K. 1970].



Проточная цитофлуориметрия. Исследование проводили для определения принадлежности белоксодержащих фракций к секретируемым антигенам микробной клетки на проточном цитофлуориметре FacsCalibur (Becton Dickinson, США). Результаты рассчитывали с помощью программы WinMdi 2.8.



Методы химического анализа. Определение углеводсодержащих соединений проводили по методу Дюбуа [Dubois М. et al. 1956]. Содержание белка определяли по методу Лоури [Lowry О. Н. et al. 1951]. О присутствии ЛПС в препарате судили по уровню 2-кето-З-дезоксиоктаната (КДО) [Waradwaker et al. 1945] и подтверждали гель-тромб ЛАЛ (лизат амебоцитов limulus) - тестом PYROGENT® (CAMBREX Bioscience, США) в соответствии с ОФС 42-0002-00. Содержание нуклеиновых кислот в препарате определяли по уровню органического фосфора [Lowry О. Н. et al. 1954].



Иммуноблоттинг. Проводили денатурирующий электрофорез в ПААГ осуществляли сухой перенос на нитроцеллюлозную мембрану. После адсорбции первичных антител (исследуемая сыворотка) проводили отмывку (3 раза в ФСБ + 0,1 % Tween-20). Затем инкубировали с коньюгатом anti-mouse IgG-HRP. После чего отмывали от не связавшегося проявителя и окрашивали диаминобензидином с Н202 в ФСБ.



Получение препаратов для иммунизации животных. К белоксодержащим фракциям прибавляли 2%-ную гидроокись алюминия (Serva, Германия) до конечной концентрации 0,02%. Инкубировали в течение ночи при +4°С, затем отмывали центрифугированием.



Протеолиз белковой фракции 30-50 кДа осуществляли с использованием протеиназы К (выделенной из Tritirachium album, AppliChem, Германия) в соответствии с рекомендациями изготовителя. После протеолиза низкомолекулярные продукты деградации удаляли из раствора ультрафильтрацией с использованием мембргнл YM-30.



Протективная активность препаратов. Мышей массой 12-14 г иммунизировали двукратно с интервалом 14 суток, чередуя внутрибрюшинное введение с подкожным. Заражали тест-штаммом на 12-14 сутки после последней иммунизации. Для определения величины LD5o в заражающей дозе одновременно вводили группе интактных мышей кратно возрастающие дозы К pneumoniae Оценивали процент выживших мышей и величину ED50 в опытных группах.



Антигенную активность исследуемых фракций определяли по оценке уровня антител в ИФА с использованием IgG мыши (ГУ НИИЭМ Н. Ф.Гамалеи). Сыворотки



В разведении 1:100 наносили на полистироловые планшеты, на которых предварительно была сорбирована в рабочей концентрации (2-3 мкг/мл) исследуемая фракция К. pneumoniae 30-50 кДа. В качестве контроля использовали пул сывороток от не иммунизированных мышей или сыворотки клинически здоровых доноров. Результаты учитывали по оптической плотности на планшетном спектрофотометре «Эфос» (Россия) при длине волны 492 нм.



Определение превентивной активности. Мышей заражали летальной дозой штамма К pneumoniae К2. Через 2 часа и дважды в последующие 2-е суток мышам вводили сыворотки 5-кратно иммунизированных мышей в разведении 1:20 Опыт сопровождали контролем заражающей дозы.



Уровень цитокинов в сыворотке крови мышей определяли в ИФА при использовании тест-систем (Biosource, Бельгия), на приборе Multiscan-Plus (Labsystems, Финляндия).



Определение уровня антител к ДНК (нативная, денатурированная) проводили с помощью ИФА тест-систем [Н. Е. Ястребова с соавт.1987], а также к коллагену (Serva, Германия), эластину (INC Biomedical Inc, США), микросомальным фракциям тонкого и толстого кишечника проводили с помощью твердофазного ИФА. Отрицательным контролем служил пул сывороток от не иммунизированных мышей.



Уровень IgG антител в сыворотках больных болезнью Бехтерева (п<22) и практически здоровых лиц (п<32) определяли методом твердофазного ИФА. Сыворотки больных с верифицированным диагнозом болезни Бехтерева были получены из НИИ ревматологии МЗ РФ. В качестве отрицательного контроля использовали пул сг вороток от 100 клинически здоровых доноров. Положительными считали результаты, показавшие ДОП>+0,1 (М±2а).



Противоопухолевую активность препарата К. pneumoniae К2 30-50 кДа изучали на мышах-самцах линии С57В1/6 в возрасте 2-3 месяцев и массой 22-24 г, которым подкожно вводили клетки перевиваемого штамма меланомы В16 (банк опухолевых штаммов ГУ РОНЦ РАМН им. Н. Н. Блохина) в область подмышечной впадины. Исследуемый препарат К pneumoniae К2 30-50 кДа вводили подкожно через 24, 48 часов, а также 7 и 14 дней после трансплантации опухолевых клеток.



Эффект оценивали по объему опухоли, числу метастазов, средней продолжительности жизни мышей.



Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Excell (MicroSoft corp. США) и интегрированным пакетом статистического анализа Statgraphics Plus v5.0 (Manugistics, Inc. США) с применением параметрических методов сравнения при нормальном распределении (i-критерий Стьюдента).



РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ



Исходя из концепции, что бактерии секретирует в окружающую среду не только факторы патогенности, но и ферменты, необходимые для их жизнедеятельности, мы предположили, что получение протективных антигенов на основе секретируемых микробной клеткой антигенов, позволит блокировать с помощью антител механизмы ее адаптации в организме хозяина или системы жизнеобеспечения.



На первом этапе исследования была. определена вирулентность для белых мышей 6 штаммов клебсиелл наиболее часто встречающихся при заболеваниях человека (К2, К13, К16, К25, К48 и не типируемого по К-антигену - 204). Для дальнейших исследований были отобраны 3 штамма: К2 - вирулентный (LD5o - 31,6 микробных клеток), К16 - средней степени вирулентности (LD50 - 8,9x106 микробных клеток) 204 - маловирулентный (LD50 - 354,8х10б микробных клеток).



Выявлено, что все 3 штамма K. pneumoniae активно продуцирует только один протеолитический фермент с эластазоподобной активностью. Трипсиноподобной и химотрипсиноподобной активности не выявлено. Интересно, что штаммы, различающихся между собой по вирулентности на несколько порядков, имели примерно одинаковую эластазоподобную активность, которая составляла 5416, 7476 и 7302 мЕ/мл для штаммов К2, К16 и 204, соответственно (табл 1).



После прибавления в среду культивирования штамма К pneumoniae К16 субстрата протеазы - гликопротеина, выявлено увеличение общей протеазной активности с 7476 мЕ/ мл до 15731 мЕ/мл.



Таблица 1



Протеазная активность культуральной надосадочной жидкости штаммов _К pneumoniae различных по вирулентности_



3 Штамм Вирулентность штамма, Протеазная активность*



| rpyni Эластазо-подобная, мЕ/мл Трипсино-подобная Химитрипси-ноподобная



1 К2 Высокая 5416±574 0 ±



2 К16 Средняя 7476±112 0 ±



3 204 Низкая 7302±812 0 ±



Примечание * Протеазную активность считали значимой при величине более 150 мЕ/мл. Достоверных различий между группами не выявлено.



После фракционировании белоксодержащих фракций с помощью ионообменной хроматографии на ОЕАЕ-сефарозе и проведением элюции в градиенте ЫаС1 было получено 30 белоксодержащих фракций (рис 1).



Рис.1. Профиль элюции сконцентрированной осаждением сульфатом аммония культуральной надосадочной жидкости штамма К pneumoniae К16 и протеазная активность, выявленная во фракции №8.



Только одна из этих фракций (фракция №8) обладала эластазоподобной



Активностью равной общей эластазоподобной активности культуральной



Надосадочной жидкости. Проведение электрофореза в полиакриламидном (ПААГ)



Геле показало, что выявленная п роте аза с эластазоподобной активностью имеет молекулярную массу 21 кДа (рис.2).



Ее *да - л5 -36 кДа -29 кДа-24 кДа -



Го кДа -14 кДа -



Рис.2. Электрофорез фракции №8 в пол и акрил ам и дно м геле.



1 - набор белковых маркеров (14, 20, 24, 29, 36, 45, 66 к Да);



2 — фракция №8, с протеазной активностью. Окраска: Coumassi Urilliant Blue G250



Гель-фильтрация бело КС одержащ и х соединений, полученных из культуральной надо садочной жидкости при прибавлении гликопротеина не выявила значимых изменений » продукции белоксодержащей фракции с молекулярной массой 21 кДа, однако появился резкий выброс белоксодержащих соединений в области 50 кДа (рис 3). Вместе с этим происходило повышение продукции в среду культивирования углеводсодержащих соединений в областях 25, SO и 60 и 70 кДа, Обращает на себя внимание, что только в области 50 к Да происходил одновременный выброс в культуральную среду белка и углеводов.



Это явилось основанием для проведения последовательной ультрафильтрации и получения белоксодержащих фракций для оценки их протективной активности. Были получены, фракции с молекуляпой массой < 30 кДа, 30-50; > 50 и >100 кДа, которые после сорбции на гидроокиси алюминия использовали в качестве препаратов для иммунизации животных (табл.2).



После 2-кратной иммунизации мышей препаратами, полученными из штамма К. pneumoniae К2, на 14 сутки их заражали гомологичных штаммом в дозе 178 LDi(l. Установлено, что протективной активностью обладал только препарат с молекулярной массой 30-50 кДа, который защищал 100% мышей от заражения. Остальные препараты были неиммуногениыми.



Номер пробы



Без прибавления гликопротеина -»- с прибавлением гликопротеина в начале инкубации



9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30



Номер пробы



¦ с прибавлением гликопротеина



¦ без прибавления гликопротеина в начале инкубации



Рис.3. Профиль элюции белоксодержащих соединений (А), углеводсодержащих соединений (Б) в культуральной надосадочной жидкости



Штамма К pneumoniae К16 без стимуляции гликопротеином и со стимуляцией гликопротеином.



Далее было установлено, что препарат Kpneumoniae К2 30-50 кДа, а также препараты этой же молекулярной массы, полученные из других исследованных штаммов - К16 и 204, обладали внутривидовой перекрестной протективной активностью (табл.3).



Таблица 2



Протективная активность препаратов из штамма К pneumoniae К2 при заражении мышей на 14 сутки после 2-кратной иммунизации штаммом К pneumoniae К2 в дозе 178 LDjq



№№ группы Молекулярная масса препарата, кДа Иммунизирующая доза, мкл Заражаю щая доза штамма К2, микр. клеток в 0,5 мл Выжило ED50, мкл



Абс. %±т



1 <30 1,0 500 1/10 10,0±9,5 >100,0



10,0 500 0/10 0±8,7



100,0 500 4/10 40,0±15,5*



2 30-50 1,0 500 4/10 40,0±15,5** 2,5



10,0 500 7/10 70,0±14,5**



100,0 500 10/1 0 100,0±6,0**



3 >50 1,0 500 0/10 0±8,7 >100,0



10,0 500 0/10 0±8,7



100,0 500 1/10 10,0±9,5



4 >100 100,0 500 1/10 10,0±9,5 >100,0



6 Не вакцинированные (контроль) 500 0/10 0±8,7



Примечание: достоверность разности между процентом выживших животных в опытных группах и в контроле, * р<0,05, ** р<0,01



Таблица 3



Внутривидовая перекрестная протективная активность препаратов из штаммов К pneumoniae после 2-кратной иммунизации при заражении через 14 суток штаммам К. pneumoniae



№№ группы Штамм ДЛЯ получения препарата Мол. масса препарата, кДа Иммунизирующая доза препарата, мкл Заражение штаммом К. pneumoniae К2 в дозе 15,8 LD50 Заражение штаммом К. pneumoniae К2 в дозе 178 LD50



Выжило ED5(i, мкл Выжило ED50, мкл



Абс. %±т Абс. %±т



1 К2 <30 1 0/10 0 Но. 0/10 0 >100



10 0/10 0 4/8 50,1 ±17,7



100 3/10 30,0±14,5 3/5 60,0±22,0



2 К2 30-50 1 1/10 10,0±9,5 8,0 4/10 40,0±15,5 3,0



10 10/10 100,0±6,0** 6/10 60,0±15,5*



100 9/10 90±9,5** 6/10 60,0±15,5*



3 К16 30-50 1 3/10 30,0±14,5 8,0 3/10 30,0±14,5 60,0



10 3/10 30,0±14,5 6/10 60,0±15,5*



100 1/10 10,0±9,5 7/10 70,0±14,5**



4 204 30-50 1 1/10 10,0±9,5 2,5 3/8 37,5±15,3 2,5



10 5/10 50,0±15,8* 6/8 75,0^3,7**



100 5/10 50,0±15,8* 8/8 100,0±8,7 **



5 Не вакцинированные 1/10 10,0±9,5 1/10 10,0±9,5



Примечание: достоверность разности между процентом выживших животных в опытных группах и в контроле, * р<0,05, **р<0,01



Перекрестная протективная активность препаратов была ниже, чем в гомологичной системе. Гак, если препарат К. pneumoniae К2 30-50 кДа обеспечивал 100% защиту мышей при заражении этим же штаммом в дозе более 100 Ш3(), то при заражении штаммом К i 6 эта защита составляла 60%.



Наличие общих белоксодержащих соединений у штаммов К. pneumoniae К2, fiI6 и 204 было подтверждено при проведении электрофореза в п или акр и л а м и дно м геле. При этом были выявлены общие мажорные белковые полосы в области 35 и 40 к Да. Тот факт, что бело кс оде ржащие соединения этой молекулярной массы участвуют в защите от инфекции, подтвердился в реакции иммуиоблоттинга с антителами, полученными после иммунизации мышей препаратом К. pneumoniae К2 30-50 кДа (рис.4).



М К2 К16 К204



'fa Щ» _ ; .



PtiL. f Иммуноблот белоксодержащих фракций К. pneumoniae К2, К16 и 204 с Молекулярной массой 30-50 кДа.



Примечание: реакцию проводили с сывороткой крови мышей (первичные антитела), взятой через 14 дней после 5-кратной иммунизации препаратом К. pneumoniae К2 30-50 к Да. В качестве конъюгата использовали антителе к иммуноглобулином мыши, меченные пер икс и да! ой хрена (вторичные антитела). М - молекулярный весовой маркер (окраска — Куммасси G-250),



Учитывая тот факт, что K. pneumoniae К2 является наиболее вирулентным штаммом за счет отсутствия у нее манозосвязывающего рецептора, часто является этиологическим фактором различных острых и хронических воспалительных



Процессов у человека, а также имеет общие протективные антигены белковой природы с другими штаммами клебсиелл, более подробному дальнейшему изучению был подвергнут препарат К. pneumoniae К2 30-50 кДа.



По химическому составу препарат K. pneumoniae К2 30-50 кДа содержал 29,7 мкг/мл белка, 16,2 мкг/мл углеводов и 6 мкг/мл ЛПС (подтверждено ЛАЛ-тестом), нуклеиновые кислоты не выявлены.



Так как в полученном методом ультрафильтрации препарате К. pneumoniae К2 30-50 кДа содержались различные иммунологи чески активные соединения, нам надо было убедиться в том, что не капеульный полисахарид и ЛПС обеспечивают защиту от заражения, а секретируемые микробной клеткой белоксодержащие антигены. Было проведено дополнительное исследование но уточнению этого положения. На препарат K. pnenmoniae К2 30-50 кДа воздействовали протеи назой К для разрушения белковой составляющей. Результат и ротеол ити ч е с кого разрушения белка подтверждали при электрофорезе (рис 5, трек После этого мышей



Иммунизировали этим препаратом по обычной схеме. Выявлено, что иммунизация Препаратом, в котором белковая часть была разрушена, не защищал от заражения, тогда как нат явный препарат К. pneumoniae К2 30-50 к Да, содержащий основные белковые компоненты с молекулярной массой 35 и 40 кДа обеспечивал выживаемость 90% животных в дозе более 100 LDji. (.табл.4'),



Ml 2 3 4 5



Рис.5. Электрофорез бел оке о держащих фракций в полиакрил амид ном геле по методу Леммлн. М - молекулярный весовой маркер (14, 20, 24, 29, 36, 45 и 66 кДа); I - культуральная надосадочная жидкость; 2 - фракция < 30 кДа; 3 - фракция 30 -50 кДа; 4 — фракция > 50 кДа; 5 - фракция 30 - 50 кДа, обработанная протеиназой К



Это исследование доказало, что протективной активностью обладают белоксодержащие соединения, хотя мы не исключаем, что ЛПС и капсульный полисахарид могут участвовать в защите от заражения.



Таблица 4



Протективная активность препарата К. pneumoniae К2 30-50 с протеолитически разрушенным белковым компонентом при заражении штаммом К. pneumoniae К2 в дозе >100 LDjo



№№ Молекулярная масса Иммуни - Заражаю - Выжило



Груп - препарата, кДа зирующая щая доза Абс. %±т



Пы доза, мкл штамма К2, микр. клеток в 0,5 мл



1 30-50 (белок разрушен 100 50 2/10 20±12,6



Протеиназой К) 100 500 0/10 0±8,7



2 30-50 (нативный 100 50 8/10 80±12,6*



Препарат) 100 500 8/10 80±12,6*



3 Не вакцинированные - 5 1/10 10±9,5



(контроль) - 50 0/10 0±8,7



- 500 1/10 10±9,5



Примечание: достоверность разности между процентом выживших животных в опытных группах и в контроле, * р<0,05



Затем мы убедились в том, что полученная белоксодержащая фракция 30-50 кДа относится к секретируемым микробными клетками соединениям, а не является продуктом лизиса бактерий. Это было доказано методом проточной цитофлуорометрии (рис 6), когда антитела, находящиеся в сыворотке животных, выживших после заражения, связывались с "микробными клетками, а антитела из сыворотки животных, иммунизированных препаратом К. рпеитотае К2 30-50 кДа, не реагировали с ней. Это также подтвердилось с помощью ИФА, когда сыворотки крови мышей, иммунизированных препаратом К. рпеитотае К2 30-50 кДа не реагировали с антигенами клеточной стенки клебсиеллю. Дополнительным подтверждением отсутствия лизиса микробных клеток в культуральной жидкости является отсутствие нуклеиновых кислот в препарате.



Препарат был не токсичен для белых мышей.



Ja»QOO] 4746 (52 6 %j



10° 1П' 10s 1Q - 10'



On: 288 CV: 45.05



?36-300] 50TO (9T. S«)



Io io' 1С ioi ю;



<5ir.; 1SC. M CV: 13.44



Ю-1 Q23) ?67 C10D-046)



IV 10' 10' l'Ol I'D-4 'I ¦ - M



Рис. 6. Проточная цитофлуе:и ^етрия микробных клеток К. pneumoniae К2



A. Дот-плот клеток К. pneumoniae К2, По оси абсцисс - фронтальное светорассеивание, по оси ординат - боковое светорассеивание.



Б. Гистограмма свечения исходной популяции клеток после их инкубации со вторичными антителами, меченными FITC.



B. Гистограмма свечения исходной популяции клеток К. pneumoniae К2 после их инкубации с первичными антителами, полученными после иммунизации препаратом К. pneumoniae К2 30-50 кДа, полученным из культуральной надо садочной жидкости и вторичными антителами, меченными FI ТС.



Г. Гистограмма свечения исходной популяции клеток К. pneumoniae К2 после их инкубации с первичными антителами, полученными от мышей, выживших после заражения этим штаммом, и вторичными антителами, меченными FITC-



Так как при инфекциях, вызываемых внеклеточными патогенами, основу защитных реакций организма составляют антителозависимые иммунологические механизмы, с участием специфических IgG антител, было проведено исследование по оценке способности сыворотки, полученной от иммунизированных мышей защищать мышей от заражения К2 (табл. 5). В результате 90% мышей, получивших сыворотку иммунизированных мышей, были защищены от заражения летальной дозой штамма К pneumoniae К2. Это исследование показало, что в защите от инфекции важное значение имеют специфические антитела к секретируемым белоксодержащи м фракциям К pneumoniae.



Таблица 5



Роль антител к препарату К pneumoniae К2 30-50 кДа, полученному из культуральной надосадочной жидкости, в защите от экспериментальной клебсиеллезной инфекции (7 сутки после заражения)



№ № Сыворотка мышей, после иммунизации препаратами К pneumoniae К2 Кратность введения сыворотки* Заражающая доза, штамма К pneumoniae К2, микр. клеток Выжило/ Всего %±т



1 30-50 кДа 3 500 9/10 90,0± 9,5**



2 <30 кДа 3 500 0/10 0±8,7



3 Не вводили - 500 0/10 0±8,7



Примечание. * сыворотку вводили внутрибрюшинно через 2, 24 и 48 часов в разведении 1:20 и вводили в объеме 0,5 мл после заражения летальной дозой штамма К pneumoniae К2. ** Достоверность разности pi и 2,з <0,05



Методом ИФА было установлено, что сыворотка иммунизированных мышей содержит специфические IgG, которые появлялись в сыворотке крови через 14 дней после иммунизации, то есть на пике вторичного иммунного ответа, где ведущая роль отводится именно этому классу иммуноглобулинов. Уровень IgG антител к препарату K. pneumoniae К2 30-50 кДа повышался с 0,320±0,220 до 0,601 ±0,152 ед. оптической плотности (р<0,001)



Исследование уровня цитокинов через 2 часа после 2-кратной иммунизаци выявило высокий уровень продукции IL-6, TNF-a, IL-10, IL-12, что свидетельствуе



Об активации врожденного иммунитета (табл.6). Через неделю эти показатели снижались, хотя уровень TNF-a оставался достаточно высоким.



Таблица 6



Уровень цитокинов в сыворотке крови мышей после 2-кратной иммунизации препаратом К pneumoniae К2 с молекулярной массой 30-50 кДа



Исследования



Сыворотки



Уровень цитокинов в сыворотке крови мышей, пкг/мл



TNF-a IL-10 IL-12 IFN-y



Вакциниро-



Примечание. В скобках указана кратность повышения уровня цитокинов после иммунизации по сравнению с не вакцинированными



Иммунизация препаратом К pneumoniae К2 30-50 кДа в испытанных дозах практически не стимулировала резистентность мышей при заражении S. typhimurim 415 и S pneumoniae типа 3 через 24 часа после иммунизации, а также не тормозила, но с другой стороны и не усиливала роста метастазирования опухоли меланомы В16 у мышей при испытанных дозах и схемах введения.



Исследование сывороток пациентов с болезнью Бехтерева в высоком (45,5%) проценте случаев выявило у них наличие антител к исследуемой белоксодержащей фракции. Эти антитела могут играть как защитную роль, так и участвовать в развитии аутоиммунного процесса. Известно, что при болезни Бехтерева поражается не только соединительная ткань суставов, но и желудочно-кишечный тракт. Мы не обнаружили повышения уровня антител к коллагену, эластину, микросомальной фракции толстого и тонкого кишечника в сыворотках крови 5-кратной иммунизированных мышей. Иммунизация мышей также не вызывала повышения уровня антител к нативной и денатурированной ДНК.



Проведенные исследования показали, что препарат K. pneumoniae К2 30-50



КДа можно использовать как основу для конструирования противоклебсиеллезной



Вакцины, для иммунизации доноров с целью получения иммунной плазмы или



Иммуноглобулина для терапии больных с тяжелой клебсиеллезной инфекцией, а также при разработке диагностических тест-систем.



1. Штаммы К pneumoniae К2, К16 и нетипируемого по К-антигену 204 при культивировании в полусинтетической среде продуцируют только один протеолитический фермент с молекулярной массой 21 кДа, обладающий эластазоподобной активностью, не зависящей от степени вирулентности штамма и возрастающей при прибавлении в среду гликопротеина.



2. Внесение в среду культивирования К pneumoniae гликопротеина стимулирует одновременную продукцию микробными клетками белоксодержащих и углеводсодержащих соединений в области 50 кДа.



3. Протективная активность препарата Кpneumoniae К2 30-50 кДа, содержащего белок, углеводы и незначительную примесь липополисахарида и утрачивается при протеолитическом разрушении белка.



4 Протективные белоксодержащие соединения, входящие в состав препарата К pneumoniae К2 30-50 кДа, относятся к секретируемым продуктам микробной клетки, а не являются продуктами ее лизиса.



5. Выявлено, что внутривидовая перекрестная протективной активность препарата К pneumoniae К2 с молекулярной массой 30-50 кДа, определяется основными белковыми компонентами с молекулярной массой 35 и 40 кДа, которые являются общими для штаммов К. pneumoniae К2, К16 и 204.



6. Протективное действие препарата на основе секретируемой белоксодержащей фракции К. pneumoniae К2 30-50 кДа осуществляется путем активации антителозависимых иммунологических механизмов защиты при образовании специфических антител IgG класса.



7. Иммунизация препаратом K. pneumoniae К2 30-50 кДа вызывает повышение в сыворотке крови мышей уровня IL-6, TNF-a, IL-10, IL-12, но не приводит к стимуляции неспецифической резистености организма при испытанных дозах схемах введения.



8. Пациенты с болезнью Бехтерева чаще (45,5% случаев), чем практически здоровые лица (3,1% случаев) содержат антитела к белоксодержащей фракции 30-50 кДа.



9. Антигены белоксодержащей фракции 30-50 кДа не содержат перекрестно реагирующих эпитопов с органонеспецифическими (ДНК, коллаген, эластин) и органоспецифическими (микросомальные фракции кишечника) антигенам человека



10. Секретируемая белоксодержащая фракция К pneumoniae К2 30-50 кДа может быть использована как основа для разработки противоклебсиеллезной вакцины, а также для разработки диагностических тест-систем.



СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ



1. Воюшин К. Е. Тришин А. В. Жданович М. Ю. Савватеева JIB. Топтыгин



А Ю. Доненко Ф. В. Киселевский М. В. Курбатова Е. А. Семенов Б. Ф. протеазная активность и вирулентность ряда штаммов Klebsiella pneumoniae Медицинская микробиология 21 век. Материалы Всероссийской научно-практической конференции (28-30 сентября 2004 г.,Саратов). Под редакцией В. В.Кутырева. с. 6465.



2. Воюшин К. Е. Тришин А. В. Жданович М. Ю. Савватеева JI. B. Доненко Ф. В. Топтыгин А. Ю. Киселевский М. В. Курбатова Е. А. «Изучение взаимоствязи протеазной активности и вирулентности ряда штаммов Klebsiella pneumoniae.» Международная конференция «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных-заболеваний» («Сосновка», Новосибирская область, 8-10 сентября 2004 г.). с. 51.



3. Тришин А. В. Жданович М. Ю. Савватеева П. В. Топтыгин А. Ю. Доненко Ф. В. Киселевский М. В. Воюшин К. Е. Курбатова Е. А. Грубер И. М. С. И.Ёлкина, Н. Г.Калина Сопряженный синтез некоторых секретируемых факторов патогенности Klebsiella pneumoniae. Вестник Академии медицинских наук 2005. №9. С.43-47.



4. Воюшин К. Е. Тришин А. В. Доненко Ф. В. Ястребова Н. Е. Ванеева Н. П. Киселевский М. В. Егорова Н. Б. Курбатова Е. А. Семенова И. Б. Семенов Б. Ф.



Секретируемые белоксодержащие антигены Klebsiella pneumoniae в системе адаптивного иммунитета. Журн. микробиол. 2006.№1. с.51-56.



4. Завяка на изобретение №2006133783 (036739). Способ получения протективной белоксодержащей фракции бактерий. Приоритет от 22.09.2006.



Подписано в печать 15.01.07 г. Формат 60x84/16 Тираж 100 экз. Заказ № 25 Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им Н Н. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш. 24

 

 



КОНТАКТЫ
Народная медицина не может быть основным методом лечения! Обращайтесь первый делом к квалифицированному врачу во избежании потери здоровья и времени нужного на лечения!